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       龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽G.scabra Bunge、三花龍膽G.triflora Pall.或堅龍膽G.rigescens Franch. 的干操根及根莖，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，主治濕熱黃疽、陰腫陰癢、帶下、強中、濕疹搔癢、目赤等癥。龍膽除含有裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和環(huán)烯萜類化合物外，還含有生物堿、揮發(fā)油、多糖等成分。目前多糖提取文要采用傳統(tǒng)水浸提取法，該方法存在費時長、耗能多的缺點。有文獻報道將超聲波應用于對中藥苷類成分的提取中可以提高苷類的提出率并縮短提取時間。初步藥理實驗表明，龍膽多糖有一定的免疫增強作用。本研究考察超聲波在龍膽多糖的提取中應用的可行性，對實驗條件進行優(yōu)化，并和傳統(tǒng)水提法進行比較。

1　儀器與試藥

　　UV-2102C型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；JP600G型超聲波提取罐，武漢嘉鵬電子有限公司。試劑均為AR級。龍膽藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場，經我院中藥鑒定室沈志濱副教授鑒定為條葉龍膽。

2　方法與結果

2.1　超聲波提取龍膽多糖：稱取一定質量龍膽粉末，加入蒸餾水適量，分別用一定頻率的超聲波超聲處理，提取液濾過、濃縮、去蛋白、乙醇沉淀，得粗品多糖，真空干燥，即得。

2.2　龍膽多糖的測定

2.2.1　葡萄糖對照品溶液的制備：精密稱取105℃ 干燥至恒重的葡萄糖100mg，置于100mL量瓶中，加入蒸餾水至刻度，搖勻，備用。

2.2.2　龍膽多糖供試品液的制備：精密稱取干燥至恒重的龍膽多糖23.80mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3　苯酚溶液的制備：取苯酚100g，加鋁片0.1 g與碳酸氫鈉0.05g，蒸餾收集18℃餾分，稱取此餾分10g，加水150g,置于棕色瓶中備用。

2.2.4 標準曲線的繪制：吸取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于50mL量瓶中，加入蒸餾水至刻度，搖勻。精密吸取各溶液2mL于 10mL具塞刻度試管中，分別加入5％苯酚溶液1 mL，搖勻。迅速加入5mL濃硫酸，振搖5min，定容，置沸水浴中加熱15min,然后置冷水浴中冷卻 30min，定容，隨行空白，在490nm處測定吸光度。數據經回歸處理后，得回歸方程：A=12.886 C+0.001 5，r＝0.999 7。

2.2.5　換算因子的測定：精密量取多糖供試品溶液 0.5mL，按照“標準曲線的繪制”項下的方法測定吸光度值，計算葡萄糖的質量濃度，得換算因子f= 5.418 5。

2.2.6　多糖的測定：精密稱取各樣品溶液1mL，分別置于10mL具塞刻度試管中，按照“標準曲線的繪制”項下方法測定吸光度值，按下式計算樣品中多糖的質量分數。

C·D·f

多糖=——————×100％

W

　　式中C為樣品溶液的葡萄糖的質量，D為樣品溶液的稀釋倍數，f為換算因子,W為樣品的質量 

2.3　超聲波法提取多搪的單因素考察

2.3.1　超聲時間對多糖提取的影響：稱取相同質量龍膽粉末5份，加入蒸餾水適量后分別用一定頻率的超聲波超聲處理15、30、45、60、75、90、120min, 后處理同2.1。結果見圖1。可知，超聲提取75min 時提出量很高，多糖提出率可達14.4％。而后隨著超聲時間的延長，龍膽多糖的提取率無多大變化，并有緩慢下降之趨勢。

圖1　提取時間對多糖得率的影晌

Fig.1 Effect of extracting time on polyssacharide yield

2.3.2 pH值對多搪提取的影響：稱取相同質量龍膽粉5份，分別加入蒸餾水適量，然后分別調節(jié)pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，超聲處理75min，后處理同2.1。結果見圖2,可知，超聲提取pH值為7時提取率很高，粗多糖提出率可達14.2％。

圖2　pH　值對多糖得率的影晌

Fig.2 Effect of pH value on polyssacharide yield

2.3.3　加入蒸餾水量對多糖提取的影響：稱取相同質量龍膽粉5份，分別按藥材量與蒸餾水質量體積比為1:20、1:40、1:60、1:80、1:100加入蒸餾水，超聲處理75min，后處理同2.1。結果見圖3?？芍?，超聲提取加入蒸餾水量為龍膽粉：蒸餾水(1： 60)時提取率很高，粗多糖提出率可達14.1％。

2.4　提取條件的優(yōu)化：在單因素考察的基礎上，稱取相同質量的龍膽粉9份，分置于9個燒杯中，選用 L9<34）正交表進行優(yōu)化，結果見表1。正交實驗結果表明在龍膽粉末中加入60體積的水，在pH 7.0的條件下用超聲波提取75min得到的龍膽多糖的量很大。根據很差分析結果，影響龍膽多糖提出率的3個因素中（pH、提取時間、加水量）以提取時間影響很大，其次是加水量，影響很小的是pH。

圖3　水體積對多精收率的影響

Fig.3 Effect of water volume on polyssacharide yield

表1 L9(34)正交優(yōu)選設計及結果

Table 1 L9(34）orthogonal design and result

s

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A超聲時 B pH值 C加入蒸餾 D 多糖

試驗號 間/min 水量/倍 (空白) /%

——————————————————————————

1 1(60) 1(6.0) 1(40) 1 1452

2 1 2(7.0) 2(60) 2 1737

3 1 3(8.0) 3(80) 3 1581

4 2(75) 1 2 3 1560

5 2 2 3 1 1481

6 2 3 1 2 1392

7 3(90) 1 3 2 1492

8 3 2 1 3 1429

9 3 3 2 1 1385

K1 0.4770 0.4504 0.4273

K2 0.4433 0.4647 0.4682

K3 0.4306 0.4358 0.4554

k1 0.1590 0.1501 0.1424

k2 0.1478 0.1549 0.1561

k3 0.1435 0.1453 0.1518

R 0.0155 0.0096 0.0137

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2.5　傳統(tǒng)方法提取與精制龍膽多糖：將干燥粉碎后的龍膽生藥樣品稱取100g,用500mL石油醚回流脫脂2次，每次1h?；厥帐兔?，藥渣揮干溶劑后用 80％乙醇500mL浸漬過夜，回流提取2次，每次 2h。濾過，將藥渣用2500mL蒸餾水90℃溫浸提取60min，再用500mL蒸餾水90℃重復溫浸提取 60min，濾過，合并濾液。將此溶液減壓濃縮至200 mL用氯仿萃取多次以除去蛋白質，再加1％活性炭脫色2次，濾過，濾液加入95％乙醇使乙醇的體積分數達到80％，靜置過夜，殘渣依次用95％乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，真空干燥，得精制龍膽多糖。與超聲提取的結果比較，見表2。

3　討論

3.1 超聲波法提取龍膽多糖時，超聲時間不宜過

表2　兩種提取方法結果比較(n=5)

Table 2 Comparison of two extracting methods(n=5)

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方法　 粗多糖/g 提取率/% 多糖/%

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水提　0.152±0.021 15.20±2.10 19.80±1.57

超聲 0.168±0.022 16.80±2.20* 28.19±1.52**

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與水提相比較：*P＞0.05 **P＜0.05

*P＞0.05 **P＜0.05 vs water extracting 長。超聲處理75min時提取率達到很大，隨著處理時間的延長，提取率反而下降。原因可能是由于超聲波具有較強的剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖斷裂，從而在后處理的過程中的損失加大而影響多糖的提出率。

3.2 龍膽多糖的組成十分復雜，由多種單糖組成。目前常用的測定方法是蒽酮-硫酸比色法和苯酚- 硫酸比色法。但在實際工作中，特別是在測定天然產物中的糖測定時，測得的結果與實際情況不符。原因是這兩種方法都是以葡萄糖作為對照，這對含有多種單糖的天然多糖來說必將使測量值與實際值不符。本實驗中有將近70％的產物未被檢出，這是在多糖測定方法的研究中經常遇到的問題。如果在制作標準曲線時能夠根據多糖的組成，用多種單糖適當混合后作為對照，就可以在一定程度上改善這種情況。

3.3 植物多糖作為免疫增強劑已引起人們的廣泛關注，臨床用于腫瘤病人的治療已取得較好療效。龍膽多糖可否作為免疫增強藥物應進一步深入研究。 （中草藥第36卷第6期 江蔚新，朱正蘭）

　　產品型號：JP600G型超聲波提取/乳化機組

　　機型結構：超聲波發(fā)生器與提取罐分體式

　　超聲頻率：28KHz

　　超聲峰值功率：1000W （由原600W升級至1000W，價格不變）

　　提取罐內尺寸：直徑320 ×高250mm

　　提取罐容積：小于等于20L

　　攪拌電機功率：15W

　　攪拌電機轉速：10-30轉/min（可調）

　　電加熱功率：2KW

　　供電電源：220VAC 50HZ 

　　具有數顯時鐘可調功能

　　具有數顯功率可調功能

　　具有數顯掃頻可調功能

　　具有數顯溫度可調功能

　　武漢嘉鵬電子有限公司專業(yè)致力于超聲波提取/萃取、超聲波乳化、超聲波清洗、超聲波污水處理、超聲波酒類醇化產品的研發(fā)、生產及銷售。公司擁有多項技術。其中“數字式大功率多用途超聲波電源系統(tǒng)”獲武漢市重大科技成果獎。數字掃頻實現了用戶迫切需要的變頻要求的同時還彌補了早期雙頻或多頻技術帶來的超聲轉換效率很低的弊端。此項技術經由全國各大院校的用戶使用后反應很好。應用于植物提取、乳化、污水處理等領域，院校包括：清華大學、北京大學、浙江大學、華中科技大學、武漢大學、華中師大、中國地質大學、武漢科技大學、上海交大、浙江工業(yè)大學、蘭州大學、河南農業(yè)大學、武漢化工學院、吉林大學、四川大學、華南理工大學、華東理工大學、江漢大學、長江大學、中科院武漢植物所、昆明植物所、中科院過程所、中科院武漢物理所、武漢市藥檢所等。公司產品行銷全國除港、澳、臺外的所有省份及直轄市。售后方面：公司產品使用自主技術故性能穩(wěn)定、質量很好。公司承諾5年內免費質保。用戶采用超聲波需注意的事項：超聲波提取方面：一、被提取物需粉碎到20目或更細。粉碎越細得率越高。二、選用合適的提取溶劑。三、根據產品的特性和產量合理的安排提取工藝。

　　超聲波乳化方面：一、乳化液的配方包括乳化劑的用量。二、乳化時間的選定，并不是時間長就越好，乳化過程是分散和聚合不停的循環(huán)的過程。按現有試驗結果顯示10－15分鐘的乳化粒徑可達100納米。

　　重要的是數字掃頻的選擇，此項共有16檔選擇，數值越低則氣泡越粗、力量越大；數值越高則氣泡越細、力量越小。不同的提取或乳化物質改變數字掃頻會帶來不同的效果及效率。

　　超聲波提取天然產物包括超聲波提取多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、單糖、寡糖、多糖、糖蛋白、樹脂、膠體物、木質素、維生素、脂肪、油脂、蠟、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類、苯丙素類、有機酸、酚類、醌類、甾體化合物、抗生素類等。